真菌的DNA提取方法:
一、SDS法
基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀。
1、 试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0) EDTA 50mmol/L (pH8.0) NaCl 500 mmol/L 灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
2、 仪器
离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置
3、实验程序
(1)、离心菌体,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
(2)、 向管中加入50μL20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ,65℃保温10min,并不时摇动。
(3)、 加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。
(4)、 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7V的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30 min 。
(5)、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
(6)、 加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。
(7)、 C:I抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
(8)、 用400μL 70%乙醇洗一次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。
(9)、 电泳检测完整性。
二、蜗牛酶破壁法
(一)、试剂:
1、500 μL PBS(0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl)
2、蜗牛酶溶液中(0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌)
3、裂解液(2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L T 、Tris-HCl,pH8.0, 1mmol /L EDTA)
4、5mol/L KAc( pH 8.9)
(二)、实验程序
1、离心菌体,沉淀中加入500 μL PBS(0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl)重悬, 12 000 r /m in 离心2 m in; 弃上清, 重复悬浮一次
2、沉淀溶于100 μL 含20 mg /mL 的蜗牛酶溶液中(0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌)
3、45℃ 作用2 h
4、加100 μL 裂解液(2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L T 、Tris-HCl, pH8.0, 1mmol /L EDTA)
5、- 20℃ 冷冻, 然后室温震荡溶解, 反复3次
6、向悬浮液中加入150 μL 5mol/L KAc( pH 8.9)轻轻混匀
7、10 000 r/min离心5 min; 将上清转移到一新的1.5 mL离心管中
8、乙醇沉淀
液中的各项药