如何设计sybrgreen法荧光定量pcr引物

a) 针双标记探针引物探针设计规则

所选序列应该高度特异应该选择具二级结构扩增重要二级结构影响反应效率任何实应用期望获100%扩增反应效率意味着每循环体系内扩增都两倍增加二级结构热力比寡聚目基更稳定目基杂交失败二级结构阻碍酶扩增扩增二级结构能避免则引物退火温度要相应提高整程我要进行BLAST类似析确保特异性

通用原则

1 先选择探针设计引物使其尽能靠近于探针

2 扩增度应超400bp理想能100－150bp内扩增片断约短效扩增反应越容易获较短扩增片断容易保证析致性

3 保持GC含量20％80％间GC富含区容易产非特异反应导致扩增效率降低及SG析非特异信号

4 保证效率重复性应避免重复核苷酸序列尤其G（能4连续G）

5 引物探针互相进行配检测避免二聚体发卡结构形

b）探针设计指导

1设计引物前设计探针

2探针Tm值应68－70℃间目测探针则要仔细审查GC富含区

3探针5’端要避免鸟氨酸5’G淬灭作用即使切割种淬灭作用存

4选择C于G链作探针G含量于C降低反应效率应选择配另条链作探针

6 探针应尽能短要超30bp

7 检测探针DNA折叠二级结构

c), 引物设计指导

1引物Tm值应58－60℃间非重要我试验般都使用退火温度60℃温度5’核酸外切酶性高

2引物末端（5核苷酸）能超2GC

3引物尽量接近于探针

d循环参数

引物探针按照述原则设计循环参数确定经起始变性温度(根据Tag酶要求设定)反应要经95℃15－20秒60℃60秒于些模板45秒足够数据退火检测

e)优化探针引物浓度

于双探针反应通选择探针引物浓度优化反应结能获低CT值及相于背景说荧光值高增

引物浓度应该50nM -900nM 范围内进行优化面表格显示前引物9种能浓度组合结

探针浓度应该50－250nM范围内优化

前引物

引物 50 300 900

50 50/50 300/50 900/50

300 50/300 300/300 900/300

900 50/900 300/900 900/900

探针浓度应该（50100250nM）与9种引物浓度相组合既27种能根据前面所述循环参数Rotor-Gene进行试验

选择CT值高反应扩增曲线做续试验

g) 进步提示

通所用探针引物浓度别250nM 900nM绝数反应都浓度进行寻找佳浓度应该依照述步骤

由于引物溶解温度预测差异种探针设计程序使用三种退火温度（586062℃）优化用

引物浓度影响溶解温度高引物浓度让溶解温度提高2度左右

Primer3非用软件能避免3‘端G所我3’端G除并观察探针退火温度否比引物高8－10度

f)定量数据析

析定量数据主要两种基本

i)绝定量

ii)相定量

研究员应该根据扩增试验目决定何析定量数据

h) 绝定量

绝定量未知品与标准曲线相比较进行析般标准品已知绝浓度DNA品关于何种标准品用于标准曲线直讨论理想标准品其扩增式应该与待测品致往往能些克隆目基并与未知品比较要注意绝定量析准确性依靠标准品准确性

Rotro-Gene 用几种析绝定量数据包括标准曲线内R值反应效率都呈现外析调用标准曲线并让与标准品相调整（或重复相同标准品）功能确定斜率重复性与Y截距基础完标准曲线说单独标准品已经足够我同通道甚至通道内绘制条标准曲线提功能主要些想用SYBR-Green析两基使用者

ii)相定量

相定量指两或更基互相进行比较其结比率没确切数字检测道种检测基表达相定量叫比较CT值（⊿⊿Ct）

种彻底需要标准曲线通观察与态相关照比较表达水平（normalizer）模板与增加品间进行相定量要使种功目及参照态范围应该相类似相敏看⊿Ct（相同起始模板浓度两扩增两CT值差异）随着同稀释度模板变化两扩增反应效率致相同则the plot of log input amount versus ⊿Ct 条水平线（斜率<0.01）着初始模板浓度范围内两扩增相同反应效率检测发现效率致则应该用标准曲线基表达进行定量或优化反应使获类似效率态范围应该面两点决定（1）目基使用浓度其结都准确（2）两基定量比值都准确）